科学史梳理绿色荧光蛋白下村修2008年诺 [复制链接]

从美国来到斯德哥尔摩的日本人

年12月10日，瑞典首都斯德哥尔摩，诺贝尔奖的颁奖典礼在市中心的一座音乐厅中如期举行。这一年的诺贝尔化学奖授予给了三位科学家，随着瑞典皇家科学基金会的斯托尔克教授的介绍，第一个走到瑞典国王面前的是来自美国的日本人下村修。下村教授和哥伦比亚大学的马丁·沙尔菲、加州大学霍华休斯医学研究中心的教授钱永健因“发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）”而一起荣获该奖项。

绿色荧光蛋白是什么？为什么发现它就可以获得诺贝尔奖？下村教授他们是怎样发现了这个大家都不熟悉的物质，并对其进行开发利用的呢？我们接下来要详细介绍的这个物质已经成为现在生命科学研究领域里最重要的工具之一。

从碗水母中提取出来的研究工具

21世纪初，被称为“再生医学”的科学领域里科学家们前赴后继努力研究的课题就是“iPS细胞”。iPS是英文inducedpluripotentstemcells的缩写，中文叫做“人工多功能干细胞”。正如它的名字所示，它能分化为构成人体的余种细胞中的任意一种，具有可以成长为任何组织的潜能，被认为是万能的细胞。从前，具有这种能力的细胞被称为“ES细胞”，一直到最近几年，ES细胞移植都为再生医疗的科学家们所瞩目。但ES细胞只能通过破坏由人的精子和卵子受精而成的胚胎才能得到，而由生命的定义所引发的伦理问题成了该研究的重大障碍。而且，就算用ES细胞可以造出内脏器官，生物体所显示的对制造胚胎的精子和卵子的提供者，即接受了父母的遗传基因的“别人”的器官的免疫排斥问题还没有得到基本上的解决。

而iPS细胞可以从本人的皮肤细胞等细胞中提取，通过众多的遗传因子的组合而人工性地赋予它多功能性。通过这种方法得到的细胞不存在伦理上的问题，而且因为是本人的细胞，所以也不存在免疫排斥问题。因此iPS细胞被期待着能够在将来为再生医疗带来翻天覆地的变化。iPS细胞是京都大学山中神弥教授的科研组在7年最先得到的。

但是，通过这样的遗传因子的重组而得到的细胞真的是万能的吗？为了确认这个问题，就必须在老鼠等实验动物体内实际注入这种细胞，然后观察它全身的什么地方发生了什么样的变化，而在这个过程中，准确无误的追踪技术不可或缺。

这时，发挥了决定性作用的就是被称为“自从显微镜被发明以来”生物学上最大的革命性的工具——下村教授他们所发现的绿色荧光蛋白。这个物质也被称为“GFP”（英文GreenFluorescentProtein的缩写）。

GFP是由个氨基酸构成的蛋白质，散发绿色的荧光。物质吸收可见光和紫外线等较短波长的光后，放出较长波长的光，这种现象叫做荧光。GFP是从碗水母（水母的一种，学名维多利亚水母多管水母Aequoreacoerulescens1）的体内提取出来的蛋白质，把这种蛋白质的遗传基因转化入宿到目的遗传基因附近后，这种遗传基因就会发挥作用而使目的细胞发出绿色的荧光。因此，通过遗传基因的转化入宿来观察生物，可以一目了然地观察到目的细胞或者蛋白质在体内的什么地方发生了什么样的变化。以前就有利用能发荧光的物质作为“追踪物质”来追踪体内某种物质的方法。但都只是用荧光物质给细胞染色，还远远达不到在细胞活着的状态下观察其内部某种特定蛋白质的活动的程度。相比之下，利用GFP的方法，蛋白质在被赋予了发光性质的状态下还可以不断繁殖，所以能够严密地确定蛋白质在体内的位置。在目的蛋白质的遗传基因里结合上GFP的遗传基因，目的蛋白质就会因为GFP的存在而发出荧光。而且，目的蛋白质只是具有了发光的性质，对其生物体本身并没有不良影响。我们开始提到的山中教授的科研组确认了实验动物体内的iPS细胞的特性，也是因为在合成细胞所用的转基因2里结合了GFP的遗传基因。

现在关于癌症转移和癌细胞增殖原理的研究，GFP已经成为不可或缺的手段。把GFP和与癌症有关的蛋白质相结合，并通过追踪GFP所发的荧光，可以清楚地观察到从最初的病灶流入到血液中的癌细胞是怎样转移到其他组织，在那里又是怎么增殖转移的。

目前，在与蛋白质相关的所有生命科学的研究领域里，GFP都发挥着巨大的威力。而发现了改变生命科学研究发展潮流的GFP并引导了其具体应用的真正先驱正是下村修教授。

目睹了投在长崎的原子弹的那一天

下村修于年生于日本京都府的福知山市。下村和弟弟是在祖母的养育下长大的。祖母对他们进行了严格的教育，给当时身体不太好的下村吃了很多煎蛋和豆奶之类的有营养的东西。她经常对下村说：“日本武士就算饿着肚子也不能示弱”。

当日本在太平洋战争中明显处于劣势的时候，下村的父亲又被派往泰国，下村的学校也是*事训练的时间比平时上课的时间还长。年，为了躲避越来越频繁的美*空袭，家人被疏散到了长崎县的谏早。年8月9日上午11点，下村和同学们在目睹了从距工厂15公里左右西南方向的长崎上空飞来的B-29式轰炸机投下了两三个没有人的降落伞，之后又有其他的B-29式轰炸机飞过，大约有30秒的时间，他们眼睛什么也看不到了。之后大约40秒后巨大的爆炸声和气浪席卷而来。大家都是过了很长时间后才知道那是原子弹的爆炸。

家人一起每天采集只水母

第二次世界大战后的年到年两年时间里，下村先后报考过三所大学，但都没有被录取。“战争期间，我在谏早高中没上过一天课就毕业了，没有留下任何关于高中教育的记录。”下村在简历中写道。年，下村以班级第一的成绩从长崎大学（长崎医大于年编入长崎大学）毕业，并得到了这所大学的分析化学研究室助手的职位。四年后的年，在长崎大学教授的推荐下他“国内留学”来到名古屋大学有机化学专业的平田义正教授（以研究河豚*著称，年获文化功劳者称号）的研究室。平田研究室的气氛对下村来讲非常理想。没有人教他，他一边看着周围的人工作一边学习。下

村来到研究室的第一天，平田教授就把一个大的真空干燥置搬进研究室，对他说：“这里放着干燥的海萤”，然后交给了他研究课题：提纯荧光素。荧光素是海萤放出的让海水发出蓝光的发光物质，提纯和结晶这种物质是海外科学家经过长年的尝试和研究都没有成功的难题。但下村只用了10个月的时间就攻克了这个难题，而这也成为了他以后人生的重大转折点。美国普林斯顿大学的弗兰克·约翰森教授看到了提纯荧光素的论文后，注意到了下村的研究能力，年，他向下村发出了招聘书邀请他到美国来。平田教授知道这件事后马上以海萤的研究成功为名授予了下村博士学位，虽然下村当时并不是博士生。因为平田教授凭自己的留学经验知道，如果有博士学位就可以在普林斯顿大学拿到两倍的工资。

下村靠富布赖特奖学金的资助得到了旅费，通过相亲和药学部的毕业生大久保明美结婚，开始准备前往美国，终于在9月17日抵达了位于新泽西州中部的普林斯顿大学。之后他和约翰森教授投入到了新课题的研究中，即研究另一种海洋发光生物碗水母的发光机理。

前面讲到的海萤的发光机理是由被称为“荧光素——荧光素酶反应”的化学反应产生的。即海萤产生的发光素——荧光素蛋白质在荧光素酶的催化作用下氧化，这种氧化了的荧光素再和二氧化碳相结合而发出荧光。但碗水母却是由其伞周围排列的数百个发光器官发出绿光，与“荧光素——荧光素酶反应”具有不同的发光机理。

下村和约翰森在位于华盛顿州的星期五港的普林斯顿大学研究室里建立研究据点，开始了碗水母的采集和发光物质的提纯精炼工作。但一只水母里只含有其极微量的发光物质，为了提取它就必须先收集数量庞大的水母。下村马上开始着手这个听起来遥遥无期的工作，实验所需的几乎所有的水母都是他自己收集的，他不依赖销售水母的公司或助手，只偶尔雇佣打工的高中生。从年年末开始，他动员妻子和年幼的女儿全家一起出动收集水母。就这样，下村一家在每年夏天水母出现的时候就到星期五港收集无数漂浮在海里的水母。柔软的水母很容易受伤，所以他们在水里把水母翻过来后用手抓进手工制作的网兜里。他们一天收集只，一个夏天能收集5万到10万只的水母，然后把它们搬运到废仓库改选的临时处理厂。约翰森教授把切肉用的刀改造成“水母刀”，用它快速地把发光器官集中的水母伞的边缘切下来，然后再从中提取蛋白质做成被称为“水母蛋糕”的蛋白质块。整个夏天的成果也就是比足球还小的一个水母蛋糕。

终于解开了碗水母的发光机理之谜

年，下村和约翰森通过精炼这些水母蛋糕确定了发光蛋白质。他们把这个蛋白质命名为水母发光蛋白，并阐明了它之所以发光的机理。这个名字是根据碗水母的学名里的水母而命名的。他们发现，水母发光蛋白存在于水母的发光器官中，它与细胞内的钙离子结合后分解变成脱辅水母发光蛋白和氧化荧光素，发出蓝色的光（特征峰波长是nm）。但这却与水母本来发出的绿光颜色不同，水母的发光机理一定还与别的物质有关。做了这样的预测之后，下村他们开始收集精炼更多的水母蛋糕。

几个月后，他们终于成功地分离提取出了绿色荧光蛋白质GFP，原来是水母发光蛋白与GFP形成了复合体的缘故。终于在年被完全阐明的发光机理是这样的，GFP在吸收了水母发光蛋白吸收钙离子后发出蓝光，之后又变成波长为nm的绿色荧光。这个反应被称为“荧光共振能量转移”。GFP不仅能吸收水母发光蛋白的蓝色光，只要接收到从外部而来的激发3光能量，GFP还可以自己发光。下村他们为完成这项研究共捕获水母85万只，总重量达50吨。

GFP应用开发的先驱者最后成为时薪10美元的司机

虽然下村他们首次从生物体内提取出了荧光蛋白质分子，也发现了它的发光机理，但在当时他们并没有想到这个水母发光蛋白和钙离子相结合而发光的事实会有什么应用价值。

在几年之后的年，GFP的应用方法才开始被陆续开发出来。当时在马萨诸塞州的伍兹霍尔海洋研究所（MBL）任助手的生物化学研究者道格拉斯·普蜡石对GFP接受从体外而来的能量而发出荧光的这一特性很感兴趣，如果把GFP与其他的物质相结合，那它会不会就成了调查生物体内的组织和细胞举动的示踪物质呢？普蜡石花了五年的时间，终于在年成功解读了GFP遗传基因。可遗憾的是，他的研究经费也到此为止，他没有完成最初设定的目标，GFP作为示踪物质的研究告一段落。但哥伦比亚大学的生物学家马丁·查尔菲读了普蜡石的论文后察觉到了GFP遗传基因应用的广大前景。他同普蜡石联系，希望拿到GFP遗传基因，普蜡石很爽快地答应了。就这样，普蜡石转让给查尔菲的GFP研究在以后有了非常大的进展。而打开了GFP应用研究突破口的普蜡石被伍兹霍尔研究所解雇。后来，他又在农业部和美国国家航空航天局（NASA）短期工作过一段时间，但都因为预算削减而被裁员。迫于生计，普蜡石最后来到位于阿拉巴马州汉茨维尔的丰田交易所，做了一个时薪10美元的送迎顾客的司机才得以糊口。

年下村修和马丁·沙尔菲、钱永健（后述）因“发现并发展了GFP”而一起获得了诺贝尔化学奖。颁奖当日，沙尔菲和钱永健合力出钱请普蜡石和他的妻子来到了斯德哥尔摩，还在颁奖仪式上向在场观众们介绍了他的业绩，下村、查尔菲和钱永健在获奖感言里都向普蜡石表示了感谢。

完成从发现到应用的转化

继承了普蜡石的研究的沙尔菲想通过实验确认是否这种蛋白质无论在什么样的细胞中都会放出荧光。首先，他在最有代表性的原核生物—大肠杆菌的基因里植入了被克隆的GFP基因。然后在乳酸培养基上进行培养，对由此生成的克隆物用能够激发GFP发光的紫外线试着进行了照射，结果，克隆物全体发出了绿光，而大肠菌本身没发生任何健康问题。这之后沙尔菲又用真核生物中最具代表性的叫做秀丽隐杆线虫作了实验，在它的神经细胞中的蛋白质β微管蛋白的遗传基因里结合了GFP遗传基因。在用紫外线照射线虫后，他清楚地观察到了沿着体内的神经细胞发出的绿色荧光。这样，沙尔菲首次成功地把GFP导入到异种细胞里并使其单独发挥作用。而且，这样处理后的生物并没有发生异常，证明了GFP作为示踪物质的作用。

年，这个研究结果发表后，GFP一下子变得众所周知，关于它的研究也霎时成为时代的宠儿。

虽然GFP的光具有即使在体外也可以被感知的强度，但考虑到将来可能在人体的内部使用，它的强度还是不够，他们想要能发出更强荧光的蛋白质。另外这个荧光蛋白质只能发出绿光，如果能发出各种颜色的光的话，就可以根据用途分开使用，也可以把同一种生物体内的不同分子染成不同的颜色。在具有这种想法的人之中，有一位就是加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物学药学部的钱永健教授。

年，钱永健通过改良GFP遗传基因而稍微改变了氨基酸的序列，开发出了光的波长虽然相同，还是在绿光的范围内，但光的强度却得以提高的改良型GFP。年，钱永健又改良了氨基酸的序列，开发出了荧光波长变长或变短，能发出不同颜色的光的变异型GFP。由于这些变异型是通过不同波长的紫外线照射而被激发的，因此虽然在同一个细胞里，却可以根据发光颜色的不同来同时显示多个蛋白质的不同机能。其他的效果也逐渐被发现：这些结合了追踪物质的两个分子接近时会产生被称为“荧光共振能量转移”的现象。因此，用激发其中一个分子的波长的紫光照射后，其能量会转移到另一个分子上，而接受到能量转移的分子就会发出荧光。利用这个原理可以观察到生物体内正在进行的蛋白质之间的复杂的相互作用。

距下村的发现半个世纪后的今天

如果把到目前为止GFP发现、发展的过程比喻为电视技术的话，下村修发现，普蜡石和沙尔菲发展应用的绿色GFP相当于初期的黑白电视，而钱永健开发的多色荧光蛋白质就相当于彩色电视。而随着从黑白到彩色的进步，其传达的信息数量也有了飞跃性的扩大。利用这个多色彩的特性，现在有五花八门的研究正在进行着。比如哈佛大学的脑科学家杰夫·利克特曼在老鼠的脑细胞遗传基因里植入了*、红、蓝三种荧光蛋白质的遗传基因。它们分别和不同的脑内物质相结合，根据其在神经细胞内的生长状况不同，每个细胞全体的颜色发生各种各样的变化。把这样做成的老鼠脑切片放在紫外线下照射，每个神经细胞的颜色缤纷闪烁，看起来宛如彩虹或者印象派大师的抽象画。细胞的颜色多达八十多种，利克特曼把这种状态下的老鼠命名为“彩虹老鼠”（也叫荧光老鼠），以强调脑与彩虹的组合。随着这个染色方法的实现，钱永健的梦想也实现了，识别每个脑细胞变得容易了，追踪细胞之间的接线，确认细胞的病变也比原来更迅速更准确了。荧光蛋白质的遗传信息已经被公开，现在，全身细胞都发荧光的老鼠的系统也已经被确立。而且在宠物店，可以看到通过遗传基因改造而能发出各种颜色荧光的观赏性热带鱼。

可是从生物学的角度来看，通过遗传基因重组而被植入了荧光蛋白质的蛋白质并不是不会发生任何问题。的确，被植入了荧光蛋白质的普通蛋白质还照常工作，细胞的机能看起来也没发生什么异常。可是，蛋白质本来具有的机能是由它的立体结构决定的。那么，普通的蛋白质在植入了作为异物的荧光蛋白质之后，它本来的机能还能完全发挥出来么，有没有因此而引发异常的可能性呢，这些问题都还没有得到确认。为了避免这些问题的发生，至少要保证荧光蛋白质的质量及其微小，而且不能妨碍目的蛋白质的正常工作。另外，现在荧光蛋白质的发光能力还不是完全稳定，还达不到完全准确的追踪特定分子的水平。因此，世界各地的科学家们正在努力探索质量更小、荧光强度更强的新物质。

下村修在20世纪50年代和60年代里采集了不计其数的释放绿色荧光的碗水母，一直到从中发现荧光蛋白质GFP，时间又过了半个世纪，他的业绩不仅得到了诺贝尔奖的表彰，那之后的研究者们更是将其发扬光大，使之成为下村自己当时都没有预想到的重要的科学研究的工具。